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Il sequenziamento del DNA è un metodo che permette di ottenere la sequenza nucleotidica completa di un gene, o di uno specifico frammento di DNA.

Lo studio della sequenza nucleotidica di un gene consente di evidenziare, ad esempio, eventuali mutazioni associate a malattie. Inoltre, la comparazione fra le sequenze di uno stesso gene, appartenente a due organismi differenti, può dare informazioni relative al grado di omologia tra i due organismi.

Metodologie per il sequenziamento del DNA

Ci sono due metodologie di sequenziamento del DNA, entrambe sviluppate verso la metà degli anni ’70:

1 ) Metodo di degradazione chimica (Maxam & Gilbert)
2 ) Metodo di terminazione di catena (Sanger)

Metodo di degradazione chimica (Maxam & Gilbert)

Il metodo di degradazione chimica consiste nella determinazione di una sequenza di DNA a doppio filamento mediante un taglio, che viene eseguito con l’uso di reagenti chimici, in corrispondenza di specifici nucleotidi.

E’ un metodo oramai in disuso a causa della tossicità dei reagenti e della scarsa possibilità di automatizzare il processo.

Metodo di terminazione di catena (Sanger)

Il metodo di Sanger è basato sulla determinazione della sequenza di una molecola di DNA a singolo filamento. Il procedimento avviene mediante la sintesi enzimatica di catene nucleotidiche, complementari al singolo filamento di DNA da analizzare, che terminano in corrispondenza di specifici nucleotidi.

Questo metodo segue lo stesso principio della PCR, ovvero si basa sulla sintesi di un filamento di DNA complementare al DNA da analizzare mediante utilizzo di: un innesco (chiamato primer), di una DNA polimerasi e di un pool dei quattro nucleotidi (adenina, timina, citosina e guanina, cioè le “lettere” che compongono il DNA).

A differenza della semplice reazione di polimerizzazione, viene anche inserita una piccola quantità di 4 nucleotidi terminator marcati ognuno con un fluorocromo di colore differente.
La polimerasi non discrimina fra un nucleotide normale e uno terminator, ma se quest’ultimo viene inserito la polimerizzazione viene interrotta.

In questo modo viene generato un insieme di frammenti di DNA di diversa lunghezza, ognuno terminante in corrispondenza di uno specifico nucleotide che può essere discriminato mediante corsa elettroforetica su gel di poliacrilammide.

Nei sistemi automatizzati la corsa elettroforetica avviene all’interno di un tubo capillare.
Quando i frammenti di DNA percorrono il capillare sono attraversati da un raggio laser che eccita la fluorescenza del fluorocromo, essa viene rilevata da una cellula fotoelettrica e il segnale viene elaborato e convertito in un forma grafica, chiamata elettroferogramma, che corrisponde ad una sequenza di picchi di quattro colori diversi: ognuno di essi rappresenta un nucleotide.
(S.G)